DNA分子指紋技術於動植物刑事科學之應用

洪國翔

國立屏東科技大學農學院生物資源博士班

西元2015年,聯合國會員國制定為期15年的17個可持續發展目標(SDGs),這些目標呼籲各國採取緊急行動,實現地球上所有人能有更美好且可持續的未來(聯合國,2017年)。其中目標15號為「保育及永續利用陸域生態系,以確保生物多樣性,並防止土地劣化」。此目標共有14個指標來衡量,第15.7號指標表示我們必須採取緊急行動來終結盜獵和走私受保護的植物和動物,同時解決非法野生動植物產品的需求和供應問題(聯合國,2017年)。在過往,很難利用個體的遺傳特徵來區分物種或鑑定其地理來源,但現在基於DNA分子指紋技術(DNA fingerprinting)的快速發展,使其可作為一種高效率的工具,用於識別個體的遺傳組成。物種、族群或個體間的遺傳變異是受到演化歷史、地理環境、氣候、傳播能力和天擇壓力的影響,DNA分子指紋技術可藉由通過篩選生物體內基因組的獨特遺傳變異來識別樣本中的物種/個體,最主要的原因在於每個物種或個體都有其獨特的「DNA指紋」,類似於人類的指紋,因其具有的遺傳組成與其他物種或個體具有明顯差異,即使是兄弟姊妹也有所差異。這種技術目前廣泛使用於人類法醫學,包括比對犯罪嫌疑人的DNA證據、親子鑑定以及尋找失蹤人員和人類社會中的身份識別(Machado and Granja, 2020),同時亦可應用於野生動植物保護和管理(Gupta, 2018),後者則屬「野生動植物DNA法醫學」(Animal/Plant DNA forensics)領域,為保育遺傳學 (Conservation Genetics)的分支,是將分子技術應用於動植物身上進而產生DNA證據,藉以支援執行法律保護野生動植物的法規(Cardinali et al., 2023; Moore et al., 2019; Zaya et al., 2012)。


常使用的DNA分子指紋技術包括隨機擴增多態性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD)、擴增片段長度多態性(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)、微衛星(Microsatellite DNA)或簡單重複序列(Simple Sequence Repeats, SSRs)、單核苷酸多態性(Single-Nucleotide Polymorphism, SNP)、線粒體/葉綠體/核DNA條碼(DNA barcode)等方法。其中微衛星DNA的應用不僅限於人類,也被廣泛應用於動植物刑事案件的解決,微衛星DNA是一種遺傳標記,通常用於人類DNA鑑定和法醫學研究,微衛星DNA在不同物種或個體間特定基因座的微衛星序列,因為序列變異導致重複次數不同,造成長度上的變異(Tachida and Iizuka, 1992),這些序列在不同個體之間變化很大,然而具有高度多型性,加上呈現共顯性(Codominance)的孟德爾遺傳型式(Cipriani et al., 1999)、易以聚合酵素連鎖反應偵測、再現性高以及具多對偶基因等特性,其變異性使得微衛星DNA成為一個理想的遺傳標記,用於識別不同動植物個體之間的差異,近年來則廣泛應用在野生動植物DNA法醫學範疇。

以下則簡要說明應用範疇

1. 物種鑑定(Species Identification)

動植物DNA的遺傳分析中最常見的法醫學應用,主要在於物種鑑定,尤其是用於打擊偷獵、盜採等非法事件及動植物產品的鑑定 (Gupta et al., 2005; Huang et al, 2017; Zaya et al., 2012),其基礎在於遺傳標誌物在種間具有變異,但在種內則相對保守。在動物中,最常用的標記是粒線體DNA中的細胞色素b (cytochrome b, Cyt b)和细胞色素C氧化酶(cytochrome oxidase subunit 1, COI)基因,而在植物中則為葉綠體DNA中的兩基因間的轉錄間隔區(internal transcribed spacers),如rpl32-trnL, rps16-trnQ, trnE-trnT, trnH-psbA, trnL-trnF等(Graham et al., 2022)。對於以動植物為受害者或以非法販賣受保護物種為犯罪的調查,會牽扯到人類犯罪行為,因此,樣本的收集和保存也必須遵循現今法醫調查的標準,也必需要特別關注證據的完整性和可追溯性。Graham et al., (2022) 則利用葉綠體DNA片段針對來自不同供應商的 10 個罌粟屬(Papaver)種子樣品進行定序,並進行樣品間比較,結果顯示葉綠體中的trnH-psbA 和 petA-psbJ 區域可望用來分辨罌粟屬中的三個不同物種,並將可應用查扣的藥物中是否含有罌粟成分。

2. 追溯樣本地理來源 (Tracing of Sample Geographical Origin)

野生動植物的非法貿易已經成為全球性問題,危害著生物多樣性和生態平衡,為解決此類問題,DNA相關的追溯技術逐漸應用於確定野生動植物製品及查扣個體地理來源,主要原理是通過分析個體的DNA來尋找具有地理變異性的遺傳標記,藉由與基因型資料庫中的資料進行比對,從而確定個體的可能地理起源,對動物而言查扣或走私的活體樣本未來可根據此方法評估其未來野放的可能地區,對植物而言也可以知道其是否來自於採集至合法的區域,但此方法則必須建立一個完整遺傳資料庫,能代表所有潛在來源群體的等位對偶基因頻率,並輔以統計分析了解其可能的分布機率。Huang et al (2017)則利用微衛星DNA標誌物來探討台灣特有物種牛樟木頭樣本的可能來源地,期望未來可應用於查扣木頭取證上,藉由該研究的盲測分析顯示未知的木頭樣本皆可準確地比對回真實的來源地,同時該研究所使用的微衛星標誌物也可以應用於牛樟與其他近緣種的鑑定。

3. 個體鑑定(Identification of Individuals)

不同個體其所具有其遺傳組成會有所差異,因此進行DNA分析時,若兩樣本具有相同的基因型時,可假設兩樣本來自同一個體,但這樣的方法受限於所選用的標誌物的數量以及解析度,因此在進行相關分析時仍需先知道兩個隨機不同個體具有相同基因型的機率值(probabilities of identity of unrelated individuals, PID),藉以了解分子標誌物的變異度高低。Zhao et al., (2018)利用微衛星DNA分子標誌物進行肉品追溯,其中23個微衛星DNA可作為中國市場6個豬種的個體識別和肉類追溯的標記,研究中追蹤18份血液和相應的肉品具有100%的確認機率,同時也說明標誌物數量的增加,PID數值降低,進而提高追溯準確性。

4. 譜系鑑定(Pedigree Identification)

譜系鑑定主要用於確認個體之間的家族關係,在人類通常用於親子關係或其他親屬關係的鑑定,然而在眾多畜產動物中譜系鑑定有其重要性,藉由譜系的了解將可以建立良好的配種制度減少配種過程中所造成的近親交配的情形,進而影響生產性狀。然而現今可利用微衛星DNA分子標誌物進行動物譜系的鑑定,Tseng et al., (2018)利用微衛星DNA來鑑定台灣鹿場內個體的譜系關係,結果顯示有高達 1/3 的配對組合皆表示個體間具有血緣關係,不同鹿場間的個體仍具有親子對、全同胞或半同胞的親屬關係且同一鹿場內個體近親交配情況比場間的情況嚴重許多。

5. 犯罪現場調查(crime scene investigations)

在犯罪現場或與受害者或嫌疑人相關的地方發現的植物證據具有為刑事調查提供寶貴證據的潛力。植物DNA有可能建立受害者、嫌疑人或犯罪現場之間的聯繫。例如從受害者身上提取的植物DNA可能用於識別犯罪發生的地點,或者從嫌疑人的衣物或汽車中分離出的種子或葉子的DNA可能會將嫌疑人放置在犯罪現場。這樣的證據可幫助警方追查犯罪的發生地點,確定嫌疑人的行蹤,或者證明受害者和犯罪現場之間的聯繫(Zaya et al., 2012)。發生在2001年9月芬蘭南部地區的兇殺案中,嫌疑犯身上發現三種苔蘚物種,分別被鑒定為Brachythecium albicansCalliergonella lindbergiiCeratodon purpureus,且這三種苔蘚植物皆生長於犯罪現場。其中B. albicansC. lindbergii是以無性繁殖方式生長,進行嫌疑犯身上以及犯罪地點苔蘚植物的基因型鑑定,結果顯示在嫌疑對象身上發現的B. albicansC. lindbergii可能源自犯罪現場(Korpelainen et al., 2003)。

未來DNA分子指紋技術在動植物法醫學應用方面具有廣闊的發展前景,隨著分子生物學技術的不斷進步和成本的降低,動植物領域的分子指紋技術將在法醫學、生態學、農業、環境科學和保護生物多樣性等各個領域中變得更為廣泛和重要。

參考文獻

Cardinali I, Tancredi D, Lancioni H (2023) The revolution of animal genomics in forensic sciences. International Journal of Molecular Sciences 24:8821.
Cipriani G, Lot G, Hung WG, Marrzzo MT, Peterlunger E, Testolin R (1999) AC/GT and AG/CT microsatellite repeats in peach (Prunus persica (L) Batsch): isolation; characterisation and cross-species amplification in Prunus. Theoretical and Applied Genetics 99: 65–72.
Graham K, Houston R (2022) Evaluation of chloroplast DNA barcoding markers to individualize Papaver somniferum for forensic intelligence purposes. International Journal of Legal Medicine. https://doi.org/10.1007/s00414-022-02862-6 Advance online publication.
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Zaya DN, Ashley MV (2012) Plant genetics for forensic applications. Methods in molecular biology 862:35–52.
Zhao J, Li T, Zhu C, Jiang X, Zhao Y, Xu Z, Yang S, Chen A (2018) Selection and use of microsatellite markers for individual identification and meat traceability of six swine breeds in the Chinese market. Food Science and Technology International 24(4):292–300

作者簡介

洪國翔 教授

主要研究方向為演化生物學、植物系統分類學、族群傳學、保育生物學、微生物總體基因體學。